黨堅持團結反對分裂、堅持進步反對倒退，同國民黨頑固派的反共活動進行了堅決斗爭。1939年冬至1940年春，國民黨頑固派掀起第一次反共高潮，黨給予堅決回擊。1941年初，國民黨頑固派制造震驚中外的皖南事變。新四軍軍部及所屬部隊9000余人，在向北轉移途中遭到國民黨軍8萬余人圍攻，除約2000余人突圍外，一部被打散，大部壯烈犧牲或被捕，軍長葉挺在同國民黨軍進行戰場談判時被扣押，副軍長項英遇害。事變發生后，蔣介石竟誣稱新四軍“叛變”，宣布取消其番號。

面對國民黨頑固派掀起的又一次反共高潮，共產黨采取軍事上嚴守自衛、政治上堅決反擊的方針。中共中央軍委宣布重建新四軍軍部，任命陳毅為代軍長，劉少奇為政治委員。毛澤東揭露國民黨頑固派破壞抗戰的陰謀，提出懲辦禍首、釋放葉挺、廢除國民黨一黨專政、實行民主政治等十二條解決辦法。周恩來在重慶向國民黨當局提出嚴重抗議，并親筆題詞“為江南死國難者志哀”和“千古奇冤，江南一葉；同室操戈，相煎何急?!”這兩條充滿悲憤的題詞在《新華日報》登出，有力地揭露和聲討了國民黨頑固派的反動行徑。

全國人民及國際輿論普遍同情共產黨，譴責國民黨當局消滅異己、破壞抗戰。國民黨頑固派陷于極端孤立的境地，其反共活動不得不有所收斂。黨以大局為重的正確措置，使極度危急的國內時局得以扭轉，黨在全國的政治地位空前提高。

黨深刻地總結同國民黨頑固派斗爭的經驗，豐富和發展了統一戰線的策略。這主要是:在抗日民族統一戰線中要采取“發展進步勢力，爭取中間勢力，孤立頑固勢力”的總方針，在反對國民黨頑固派的斗爭中要堅持“人不犯我，我不犯人，人若犯我，我必犯人”的自衛立場和“有理、有利、有節”的原則。這些策略原則使黨得以在復雜多變的環境里更加熟練而恰當地處理統一戰線中的各種棘手問題，避免犯“左”、右傾錯誤。

在此期間，針對國民黨大肆鼓吹“共產主義不適合中國國情”等反共謬論，黨在政治思想戰線上同國民黨展開論戰，批判和揭露各種假三民主義，著重闡述三民主義與共產主義的關系，說明共產主義的最低綱領和新三民主義基本相同，但兩者又有區別，共產黨將同一切真誠的三民主義者長期合作。這場論戰對新民主主義理論體系的形成起了推動作用。

為了駁斥國民黨頑固派的反共宣傳，向全黨和全國人民闡明共產黨對于中國革命及其前途的全部見解，回答中國向何處去這個關系重大的問題，更好地指導抗戰和中國革命，毛澤東進行了大量的理論研究工作。他系統總結中國革命的獨創性經驗，于1939年底1940年初先后發表《<共產黨人>發刊詞》、《中國革命和中國共產黨》、《新民主主義論》等著作，完整地闡述了新民主主義理論。

毛澤東指出，半殖民地半封建社會的性質，決定了中國革命必須分成兩步走，第一步進行民主主義革命，第二步進行社會主義革命。中國民主革命在五四運動以后已經不是資產階級領導的民主革命，而是新民主主義的革命。新民主主義革命是無產階級領導的人民大眾的反帝反封建的革命。區別新舊民主主義革命性質的根本標志是無產階級領導權問題。

新民主主義革命的基本綱領是:政治上，推翻帝國主義和封建主義的壓迫，在中國建立一個以無產階級為領導的、以工農聯盟為基礎的各革命階級聯合專政的民主共和國。經濟上，沒收操縱國計民生的大銀行、大工業、大商業，建立國營經濟；沒收地主土地歸農民所有，并引導農民發展合作經濟；允許民族資本主義經濟的發展和富農經濟的存在。文化上，廢除封建買辦文化，發展民族的科學的大眾的文化。

新民主主義的發展前途，必然是社會主義。新民主主義革命和社會主義革命是兩個不同的革命階段，不能畢其功于一役，但兩個革命階段必須也必然是相互連接的，不容橫插一個資產階級專政。實現黨在民主革命階段的最低綱領，也是為著將來實現最高綱領。新民主主義革命是以共產主義思想為指導的。

統一戰線，武裝斗爭，黨的建設，這是中國共產黨在中國革命中戰勝敵人的三個主要法寶。“統一戰線和武裝斗爭，是戰勝敵人的兩個基本武器。統一戰線，是實行武裝斗爭的統一戰線。而黨的組織，則是掌握統一戰線和武裝斗爭這兩個武器以實行對敵沖鋒陷陣的英勇戰士。”

以毛澤東為主要代表的中國共產黨人創立的新民主主義理論，是馬克思列寧主義同中國革命實際相結合的產物，是中國革命特別是建黨以來歷史經驗的全面總結，是毛澤東思想在抗戰時期最重大的理論成果。它的提出，使全黨和全國人民對中國新民主主義革命的性質、內容、領導權和發展前途等有了明確而完整的認識，對中國革命的勝利發展具有重大的指導作用。